细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。现在我们就来讲讲如何正确的冻存细胞：

一、材料

（一）仪器 　　1. 净化工作台 　　2. 离心机 　　3. 恒温水浴箱 　　4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 　　5. 倒置相差显微镜 　　6. 培养箱 　　7. 液氮冰箱

（二）玻璃器皿 　　1. 吸管（弯头、直头） 　　2. 培养瓶 　　3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 　　4. 废液缸

（三）塑料器皿 　　1. 吸头 　　2. 枪头 　　3. 胶塞 　　4. 移液管（10ml） 　　5. 15ml离心管 　　6. 冻存管（1～2ml）

（四）其他物品 　　1. 微量加样枪 　　2. 红血球计数板 　　3. 记号笔 　　4. 医用橡皮膏 　　5. 移液枪

（五）试剂 　　1. D-Hanks液 　　2. 小牛血清 　　3. 培养液 　　4. 双抗（青霉素、链霉素） 　　5. 胰蛋白酶（0.08%） 　　6. 1NHCl 　　7. 7.4%NaHCO3 　　8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油
二、操作步骤

（一）细胞冻存 

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；

3. 离心1000rpm，5min；

4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的zui终密度为5×106/ml～1×107/ml；

5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ 　　min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中**，取出冻存管，移入液氮容器内。

（二） 细胞复苏

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

3. 离心， 1000rpm，5min；

4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

5. 次日更换一次培养液，继续培养。

三、注意事项

1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但为对数生长期细胞。在冻存前一天换一次培养液； 　　

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 　　

3．冻存和复苏用新配制的培养液。